熒光蛋白和探針的三光子（3P）激發(fā)目前引起了人們的極大興趣，尤其是在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。正如 Chris Xu 和其他研究人員所證實(shí)的那樣，一個(gè)重要原因是用于三光子激發(fā)的1300 nm 和1700 nm 波長(zhǎng)窗口帶來(lái)更深的穿透深度。

三光子激發(fā)還可以提供比雙光子激發(fā)更高的信噪比，并且?guī)缀鯖](méi)有離焦熒光。這就可以穿透> 1 mm 厚的大腦皮層，在活體小鼠大腦中進(jìn)行更深的成像。

同樣重要的是，1300 nm 波長(zhǎng)符合綠色熒光蛋白和探針（如葡聚糖）的三光子激發(fā)能量要求，而 1700 nm 可用于激發(fā)更長(zhǎng)波靶向，如 tdTomato。

一些研究人員希望同時(shí)激發(fā)多個(gè)探針以對(duì)哺乳動(dòng)物大腦進(jìn)行更復(fù)雜的探究。這種信息豐富的數(shù)據(jù)可以加速研究人員了解神經(jīng)連接和活動(dòng)與重要功能之間關(guān)系的進(jìn)程。

使用兩種激發(fā)波長(zhǎng)可以同時(shí)對(duì)短波和長(zhǎng)波探針進(jìn)行成像。但是，這有一些限制。首先，產(chǎn)生兩種波長(zhǎng)的光束并在顯微鏡中合并它們會(huì)很復(fù)雜（而且成本更高）。然后是功率負(fù)荷問(wèn)題；使用兩個(gè)激光源來(lái)激發(fā)活體組織意味著要在樣品上使用兩倍的激光功率。此外，直到最近，還沒(méi)有針對(duì) 1300 nm 或 1700 nm 的簡(jiǎn)單（即“一體化”）光源，因此研究人員通常會(huì)使用 1040 nm 左右的激光來(lái)泵浦可調(diào)諧 OPA 產(chǎn)生 1300 nm 或 1700 nm。

但是兩種發(fā)展的結(jié)合使得短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)探針的三光子激發(fā)變得更加簡(jiǎn)單，從而可以被更廣泛的用戶所接受。

1300 nm 激發(fā)長(zhǎng)波探針

最近的幾項(xiàng)三光子成像研究表明，1300 nm 可用于激發(fā)綠色和紅色熒光探針。然后使用過(guò)濾器在兩個(gè)相機(jī)中分別檢測(cè)來(lái)自兩個(gè)探針的光。例如Timo van Kerkoerle 和他的博士生 Marie Guillemant 使用 Monaco 和 Opera-F 產(chǎn)生 1300 nm 激光，演示了通過(guò)三光子激發(fā)在小鼠前額葉皮層中同時(shí)激發(fā)葡聚糖和 tdTomato 標(biāo)記的中間神經(jīng)元（如圖）。此處的 z 堆棧圖像顯示，紅移探針激發(fā)信號(hào)甚至在深度約為 1 mm 時(shí)也很顯著。

數(shù)據(jù)由 Timo van Kerkoerle 博士和 Marie Guillemant 提供，Neurospin，CEA Saclay。

數(shù)據(jù)由 Timo van Kerkoerle 博士和 Marie Guillemant 提供，Neurospin，CEA Saclay。

圖 小鼠前額葉皮層中葡聚糖（綠色）和 tdTomato （紅色）標(biāo)記的中間神經(jīng)元的三光子成像，深度約為 1 mm。

Chris Xu 在 2021 年發(fā)表了一篇關(guān)于多色熒光團(tuán)單波長(zhǎng)三光子激發(fā)的文章，感興趣的讀者可以點(diǎn)擊閱讀原文進(jìn)行了解。

許多常用的紅色熒光分子成像以前通常使用 1700 nm 激發(fā)到最低能態(tài)，這項(xiàng)工作表明這些常用的紅色熒光分子也可以在 1300 nm 激發(fā)到更高能量電子態(tài)。這種新的激發(fā)機(jī)制允許僅使用 1300 nm 激光在小鼠大腦中進(jìn)行雙重綠色和紅色三光子熒光成像。

我們相信 Timo van Kerkoerle 和 Chris Xu 的這些發(fā)現(xiàn)顯然會(huì)對(duì)成像和功能性熒光探針的三光子激發(fā)的未來(lái)發(fā)展方向產(chǎn)生影響。

一體化 1300 nm 脈沖光源

新近推出的Coherent Monaco 1300 一體化激光器，為三光子激發(fā)提供了 1300 nm 飛秒光源。由于三光子圖像亮度與激光峰值功率的三次方成正比，這款激光器的短脈沖寬度和高峰值功率的特點(diǎn)，非常適合三光子成像。

1. 簡(jiǎn)單易用的自動(dòng)化光源，脈沖寬度小于 50 fs。

2. 高達(dá) 2.5 W 的功率輸出，可選擇 1、2 或 4 MHz 重復(fù)頻率，支持快速圖像采集。

3. 高質(zhì)量（M2 <1.3 ），在三維空間上提高顯微鏡的成像數(shù)量、成像效率和圖像分辨率。

4. 一體化結(jié)構(gòu)還包括兩個(gè)常用功能選項(xiàng)，從而簡(jiǎn)化三光子成像并提高圖像亮度。

• 提供動(dòng)態(tài)功率衰減／門控的全功率控制（TPC）功能

• 提供色散預(yù)補(bǔ)償以在樣品處獲得理想脈沖寬度的緊湊型脈沖壓縮器（CPC）

三光子成像的美好未來(lái)

使用單個(gè)激光源激發(fā)多個(gè)探針有望推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，該技術(shù)基于跨皮層深層映射多種細(xì)胞類型，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦容量的快速、信息豐富的成像。三光子激發(fā)技術(shù)和相關(guān)機(jī)制的發(fā)展無(wú)疑有助于為正在決定選擇可調(diào)諧還是單波長(zhǎng)三光子激發(fā)光源的研究人員提供指引，并突出（如 Coherent Monaco 1300 ）解決方案的價(jià)值。

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