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作者：Darryl McCoy，Marco Arrigoni；Coherent公司

非線性成像技術(shù)是一種行之有效的工具，其通過提供獨(dú)特的數(shù)據(jù)來幫助生物學(xué)家將特定的分子活動(dòng)與細(xì)胞乃至整個(gè)生物體的功能和結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系起來。目前有兩大主要發(fā)展趨勢(shì)影響著可調(diào)諧超快激光器的設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)在衍射極限或近衍射極限情況下的非線性顯微成像：第一是需要更長的波長來實(shí)現(xiàn)更深度的成像和更少的光損傷；第二是使用更加靈活的系統(tǒng)來支持多模式成像。同時(shí)，系統(tǒng)靈活性不但能減少實(shí)驗(yàn)的建立時(shí)間，而且還能令激光器的價(jià)值最大化。

更寬的調(diào)諧范圍和更長的激發(fā)波長

非線性成像能夠受益于超快激光光源更寬的調(diào)諧范圍，尤其是在長波長區(qū)域。更寬的調(diào)諧范圍能夠支持熒光體-染料、指示劑和熒光蛋白的樣品需求，這些樣品在尖端生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增加。此外，對(duì)于二次諧波和三次諧波成像而言，更寬的調(diào)諧范圍能夠使這些成像技術(shù)工作在一個(gè)更加合適的波段，而這一波段正好能夠與其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)和限制相匹配。最為重要的是，擴(kuò)展超快顯微鏡激光器的調(diào)諧范圍到更長波長，使得對(duì)更深層次組織的成像成為可能（見圖1）。

圖1：更長的波長實(shí)現(xiàn)更深層次的組織成像。圖中小鼠腦部毛細(xì)血管的MPE照片，是利用AlexaFluor 568和相干公司的Chameleon Vision II 激光器實(shí)現(xiàn)的雙光子激發(fā)成像。

之所以能夠在更深層次的組織中成像，是因?yàn)?/span>生物樣品的光散射大部分是米氏散射，正比于1/λ⁴。因此，即使激發(fā)波長有一個(gè)很小的增加（如幾十個(gè)納米），也會(huì)導(dǎo)致散射部分極大的減少，這已被證明是在深組織成像中限制信噪比的一個(gè)重要因素。

使用更長波長同樣能減少光損傷。例如，曾有研究人員證實(shí)^[1]，在大多數(shù)植物標(biāo)本上通過緊聚焦，可以使用平均輸出功率超過100mW的1280nm激光束安全地觀察到持續(xù)的多光子光譜。在同一項(xiàng)研究中，研究人員還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用波長830nm、平均功率大于10mW的鈦寶石激光束緊聚焦照射樣品時(shí)，通常在一秒鐘之內(nèi)就會(huì)觀察到由多光子吸收激發(fā)引起的破壞性等離子體的形成。在一項(xiàng)胚胎研究中^[2]，研究人員指出：“很明顯，使用800nm和1250nm高強(qiáng)度光激發(fā)有顯著的不同。較長波長對(duì)胚胎的損傷更小，可以認(rèn)為是安全輻射。”因此，較長波長同樣實(shí)現(xiàn)了高功率激光的安全使用，這反過來又促進(jìn)了最大可能的成像深度。

靈活的波長調(diào)諧實(shí)現(xiàn)多模式成像

目前有各種各樣的非線性激發(fā)技術(shù)，每一種都適于對(duì)不同種類的生物分子和微結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。例如，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）通常是通過在2840cm^-1附近激發(fā)它們的CH延展振動(dòng)、從而為脂類成像提供最佳方法。另一方面，多光子激發(fā)（MPE）是用于激發(fā)熒光蛋白、傳統(tǒng)染色劑和內(nèi)源性熒光樣品熒光的理想方式。而二次諧波和三次諧波技術(shù)最適用于膜、膠原蛋白和肌纖維，同樣也能用于一些脂類。因此，研究人員經(jīng)常想在同一個(gè)樣品上同時(shí)使用這幾種不同的方法（見圖2），或者利用兩個(gè)不同波長進(jìn)行多光子激發(fā)（MPE）。這被稱作多模式成像，理想的激發(fā)光源需要有兩個(gè)獨(dú)立可調(diào)諧的輸出波長。

滿足顯微鏡成像的需求

為了滿足長波長激發(fā)的需求，首先要擴(kuò)展自動(dòng)鈦寶石激光器的調(diào)諧范圍。具體來說，當(dāng)輸出波長超過1000nm時(shí)，鈦寶石的增益便會(huì)逐步下降。然而，調(diào)諧范圍是可以通過減少損耗和增加泵浦功率來擴(kuò)展的。例如，相干公司最新的Chameleon Vision系列激光器使用的寬帶光學(xué)元件具有極低的散射和吸收，配合使用相干公司獨(dú)特的18W、532nm泵浦激光器，實(shí)現(xiàn)了波長范圍680~1080nm的一鍵式調(diào)諧。

隨著緊湊型光學(xué)參量振蕩器的不斷發(fā)展，如相干公司的Chameleon Compact OPO，人們對(duì)使用波長大于1080nm激光的興趣也在不斷增加。通過使用集成式控制器即可輕松將波長調(diào)諧至1600nm，操作非常簡便。此外，使用可選的fan-poled OPO晶體，可以讓鈦寶石激光器和OPO在不改變光束指向的條件下實(shí)現(xiàn)獨(dú)立調(diào)諧，這對(duì)于多模式成像是非常理想的�，F(xiàn)在又增加了一個(gè)將OPO輸出倍頻得到可見光的選項(xiàng)，進(jìn)一步增加了多模式成像的選擇（見圖3）。

圖3：Fan-poled 晶體的使用，使得鈦寶石振蕩器與OPO能夠?qū)崿F(xiàn)獨(dú)立的大范圍波長調(diào)諧。OPO的輸出倍頻進(jìn)一步擴(kuò)展了多模式成像能力。圖中顯示了熒光體與成像技術(shù)是如何通過多模式成像來相互匹配的。藍(lán)色線條代表了頻率間隔為2840cm^-1的脂類CARS成像。

總結(jié)

總之，非線性或多光子成像是超快激光器的重要應(yīng)用之一。激光器制造商正在從操作的簡便性、調(diào)諧范圍和系統(tǒng)靈活性這幾個(gè)方面不斷改進(jìn)超快激光器產(chǎn)品，進(jìn)一步支持該領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

1. I.H. Chen , SW. Chu, C.K. Sun, P.C. Cheng, and B.L. Lin, Wavelength dependent damage in biological multiphoton confocal microscopy…..” optical and Quantum electronics, vol 34, 1551-1266 2003).
2. 4.  V.V. Yakovlev, Advanced Instrumentation for Raman Microscopy, J. Raman Spectrosc., vol 34, 957-964 (2003).